La Separazione Cromatografica è una tecnica classica utilizzata nei laboratori, negli impianti piloti ed in produzione, sia nelle applicazioni farmaceutiche, sia nel biotech più spinto…Ma a cosa serve e come funziona?

Essa serve appunto a separare i componenti presenti in una miscela e si compone di due fasi:

1. Fase Stazionaria, detta anche eluato, generalmente un solido
2. Fase Mobile, detta anche eluente, che può essere liquida o gassosa in base alla tecnica utilizzata: nella cromatografia liquida l’eluente è il solvente mentre in quella gas rappresenta appunto il gas di trasporto.

Nella cromatografia su colonna la Fase Mobile scende verso il basso per gravità o per l’applicazione  di  una pressione come nella HPLC High Performance Liquid Chromatography (Cromatografia liquida ad alta prestazione) o nella HRGC High Resolution Gas Chromatography (Gascromatografia ad alta risoluzione) ma in tutti i casi l’eluente trascina attraverso le apparecchiature della colonna i componenti della miscela da analizzarsi: grazie alla diversa velocità con cui i differenti componenti passano nella fase stazionaria “spinti” dalla fase mobile si ottiene una separazione più o meno accurata.

Da dove proviene questa “diversa velocità” ? Questo tipo di separazione cromatografica si basa sulla diversa affinità che un analita può avere per le due fasi, mobile e stazionaria: più è affine alla Fase Stazionaria più tempo impiega ad attraversare la colonna, più è affine alla Fase Mobile e prima esce dalla colonna. Ma all’uscita della colonna cosa trova un componente separato? Trova un cosiddetto Rilevatore cioè un Analizzatore che tramite diversi principi di misura ed un proprio software identifica e quantifica le sostanze separate producendo un apposito cromatogramma.

L’importanza del monitoraggio della Cromatografia

Nella cromatografia su colonna, sia nella Cromatografia liquida ad alta prestazione, sia nella Gascromatografia ad alta risoluzione, monitorare la Fase Mobile o l’Eluente che dir si voglia è quindi fondamentale perché tramite i parametri Conducibilità e pH è possibile modificare il Tempo di Ritenzione dell’analita quando passa attraverso la colonna cromatografica. Invece lavorando in assorbimento UV è possibile calcolare la concentrazione delle frazioni proteiche nell’eluato appena escono dalla medesima colonna.

Dove e come si esegue il controllo della Colonna Cromatografica

Durante la purificazione le misure analitiche devono essere accurate, affidabili e ripetitive per massimizzare la resa con un pooling accurato e contemporaneamente la purezza della frazione proteica/DNA ricavata quindi distinguiamo

• Pre-Colonna dove grazie alla cella monouso S.U.C. Single Use Cell modello SUC 01 si integra il nuovo Conduttivimetro a 6 elettrodi di Optek modello ACF60-SU-35 in grado di offrire un range di misura della Conducibilità pari a 0 – 150 µS/cm compensato dinamicamente dal sensore di Temperatura integrato nativamente. Ma è anche possibile utilizzare la SUC 03 per avere in un unico assieme Conducibilità, Temperatura e pH grazie al portaelettrodo di pH modello PF12 sempre di Optek che permette al Responsabile dell’Analisi di utilizzare molteplici tipologie di pH-metri secondo le proprie esigenze. La sicurezza dell’assieme è garantita dal Locking Set cioè dalla chiusura meccanica di sicurezza integrata.

• Post-Colonna: dove viene utilizzata l’analisi nel range UV liberamente integrabile nella SUC 05 con Conducibilità e Temperatura oppure nella SUC 07 per Conducibilità, Temperatura e  Come analizzare correttamente nel range UV? Un sensore optek AF45 a singola lunghezza d’onda o AF46 a doppia lunghezza d’onda entrambi operanti nel range UV non solo misurano la concentrazione delle proteine ma riescono a migliorare realmente l’efficienza del processo di separazione ottenendo non solo la purezza voluta ma anche riducendo drasticamente le analisi manuali ripetitive a banco. Vediamo ad esempio la SUC 07 con tutte le opzioni pre-integrate.

ll Conduttivimetro brevettato a 6 elettrodi quadripolo ACF60 di Optek serve invece a gestire le transizioni tra le soluzioni tampone ma anche la pulizia del processo. Con il portaelettrodo di pH modello PF12 viene invece gestito l’impaccamento gel per mezzo del valore del pH. Pertanto eventuali metodi di bilanciamento della colonna, con questo conduttivimetro, sono sempre monitorati e la performance garantita.

Perché il sensore UV con doppia lunghezza d’onda è utile?

La lunghezza d’onda principale nei modelli UV-45 e UV-46 misura la concentrazione delle proteine tipicamente a 280 nm per un pooling ottimale. Ma il modello UV-46 analizza simultaneamente la seconda lunghezza d’onda a 300 nm ottenendo un segnale che permette l’analisi anche nei range di concentrazione più alti.

Infatti la doppia lunghezza d’onda permette una risoluzione precisa a bassi valori di OD (densità ottica) per iniziare o completare la raccolta della frazione intorno ai 280 nm. Nel range superiore invece la seconda lunghezza d’onda è utilizzata per monitorare l’eluato ai valori di OD superiori.

Grazie alla modularità dei sensori in linea Optek, sono disponibili diversi cammini ottici (OPL optical path length). A seconda del range di concentrazione richiesto, la sapiente combinazione fra scelta del cammino ottico e della lunghezza d’onda permette la miglior ripetibilità e linearità dell’analisi.

Doppio Range, Conducibilità, pH, Temperatura…ma come fa l’Operatore?

Con 1 sola elettronica di Optek, il modello C8480 ad esempio, si raccolgono e si interpolano ben 5 sensori diversi per un totale di 8 parametri misurati simultaneamente e riportati anche sull’ampio display (monitoraggio multiparametrico). Ad esempio nel punto di analisi pre-colonna avremo in un singolo assieme

• conducibiltà (Optek ACF60)
• temperatura (Optek ACF60)
• pH (Optek PF12)

mentre nel post-colonna avremo sempre in un singolo assieme

• UV a doppio canale 280-300 nm (Optek AF46)
• conducibilità (Optek ACF60)
• temperatura (Optek ACF60)
• pH (Optek PF12)

Sappiamo Validare e Calibrare pH e Conducibilità ma per i sensori UV?

Certamente la validazione di conducibilità e pH vanta una storia pluriennale anche perché le applicazioni spaziano dal Farmaceutico, alla Pow-Gen fino ai Trattamenti Acque…quindi è una metodologia più conosciuta e diffusa ovunque. Ma per i sensori UV invece? Quali sono i costi occulti di ogni eventuale verifica? Occorre chiamare i tecnici della Casa Madre come al solito con uscite costose o che si presentano alle calende greche? Premesso che grazie ai nostri tecnici specialisti operanti sia sul territorio italiano che estero nessun Cliente è mai lasciato solo, Optek ha ingegnerizzato una procedura per la validazione autonoma da parte dei Responsabili Qualità o Manutenzione del Cliente senza neanche disinstallare le sonde e quindi fermare la Produzioni con poi le inevitabili pulizie costose e lunghi warm-up. Infatti si vede nella fotografia sottostante lo stesso assiemato tra le sonde Optek ma con ben visibile la finestra per utilizzare i filtri ottici o la cuvette con il liquido di processo.

Non ci sono più scuse per ritardare ancora l’ottimizzazione della Separazione Cromatografica attraverso un monitoraggio multiparametrico accurato e ad alte prestazioni…Oltre al Capex cioè all’investimento iniziale si osservi anche l’Opex cioè ai costi operativi visibili ma anche quelli occulti, ma soprattutto si immagini tutti i benefici concreti che il laboratorio e la produzione riceveranno per i prossimi anni a differenza di altre soluzioni raffazzonate o semplicistiche.